Oleanolic Acid Improves Different Aspects of Wound Healing

Abstract

Entre los compuestos naturales bioactivos, los triterpenoides pentacíclicos son conocidos por sus efectos farmacológicos y gran versatilidad, entre los cuales, el ácido oleanólico (AO), es conocido por sus propiedades antitumorales, antiinflamatorias, antioxidantes o hepatoprotectoras. La distribución de este compuesto es amplia entre especies vegetales, especialmente en el olivo, una planta muy utilizada en el Mediterráneo por su alto valor nutricional. Normalmente, el aceite de oliva se obtiene del prensado de las aceitunas, mientras que los subproductos resultantes de las aceitunas se desechan. Sin embargo, estos subproductos contienen altos niveles de AO y pueden aprovecharse para extraer este compuesto. En cuanto a sus propiedades, el AO posee efectos sobre la cicatrización de heridas, aunque en la actualidad no están estudiados completamente. La cicatrización es un proceso fisiológico necesario para la restauración del tejido después del daño en la piel. Es un proceso finamente regulado que depende de la secuencia correcta de varias fases, con el objetivo de regenerar el tejido y cerrar la herida. Diferentes tipos celulares desempeñan un papel fundamental en este proceso: las células epiteliales proliferan y migran para cerrar la herida, las células inmunitarias controlan el entorno inflamatorio causado por la lesión junto con las células endoteliales, que proliferan, migran y forman nuevos vasos sanguíneos para la regeneración del tejido. Curiosamente, se ha demostrado que el AO promueve la migración celular desde los bordes de la herida. Lamentablemente, se necesita estudiar en profundidad los efectos moleculares subyacentes a este fenómeno. Es más, la naturaleza lipofílica del AO dificulta su aplicabilidad en soluciones acuosas debido a su baja solubilidad en agua, lo que da como resultado efectos limitados del AO, presentando una baja biodisponibilidad. La presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de estos aspectos y características de la cicatrización de heridas bajo los efectos del AO, para desentrañar sus mecanismos moleculares en la biología celular. Al mismo tiempo, este estudio ha recurrido a nuevos agentes encapsulantes, las ciclodextrinas, como candidatos adecuados para la administración de AO y para mejorar así su manipulación, conservación y aplicabilidad en modelos celulares in vitro. Para estos fines, los modelos de células epiteliales Mv1Lu y MDA MB 231 se trataron con AO en ensayos de scratch, para imitar lo que sucede en un epitelio después de una lesión. Este enfoque se complementó con el estudio de proteínas clave relacionadas con la migración celular EGFR, MAP quinasas ERK y JNK, y c-Jun.

Además, también se estudiaron proteínas de la arquitectura celular: actina, paxilina y FAK; las cuales se observaron en la migración del frente celular. Además, el AO se estudió también en células endoteliales, mediante el uso del modelo de células humanas endoteliales de la vena de cordón umbilical (HUVEC). Además, se utilizaron HUVEC, afectadas por hiperglucemia (GD-HUVEC) o no (C-HUVEC), para observar los efectos promotores del AO sobre la angiogénesis. Además, con el objetivo de imitar lo que sucede en el tejido de la herida bajo inflamación, estas células fueron sometidas a un estímulo pro-inflamatorio mediante la citoquina TNF-¿, después del pretratamiento con AO, para estudiar la expresión de las moléculas de adhesión E-selectina, I-CAM1 y V-CAM1, un análisis complementado con el ensayo de adhesión de monocitos. Paralelamente, para desarrollar una nueva formulación para el AO, éste se complejó con hidroxipropil beta y gamma ciclodextrinas (HP-ß- y HP-¿-CDs). La adición de un paso de deshidratación por liofilización fue crítica para permitir la aplicación de los complejos de AO resultantes (AO/HP-ß-CD, AO/HP-¿-CD) en los ensayos in vitro. Más adelante, se testó la actividad biológica de estos complejos en células Mv1Lu y MDA MB 231, ya que son buenos biosensores de la actividad del AO. Todos estos estudios alcanzaron numerosos y prometedores resultados sobre el uso de AO en cicatrización. Las células epiteliales mostraron una sobreexpresión y fosforilación de c-Jun en las células del borde de la herida en respuesta a AO en ensayos de scratch. Sorprendentemente, las proteínas clave en migración celular EGFR, ERK, JNK y c-Jun, bajo el tratamiento conjunto con AO e inhibidores farmacológicos revelaron una activación temprana de c-Jun independiente de EGFR. El estudio de las proteínas de señalización nos ayudó a observar que la migración celular desencadenada por AO es impulsada por un mecanismo bifásico con la participación del eje JNK/c-Jun y, posteriormente, el eje EGFR/MEK/ERK/c-Jun.

Ambos ejes parecían contribuir a la migración celular inducida por AO y podrían estar intercomunicados por receptores GPCR. Además, los ensayos de migración del frente celular revelaron cambios en la arquitectura de las células epiteliales por AO, al observar modificaciones en la F-actina, la distribución de la paxilina, el número y tamaño de las adhesiones focales, la activación de FAK y la colocalización de FAK/paxilina. Todos estos efectos fueron coherentes con el mecanismo bifásico de señalización inducido por AO. Respecto a las células endoteliales, el pretratamiento con AO mostró la atenuación de los efectos pro-inflamatorios de TNF-¿, al provocar la reducción en la expresión de V-CAM1, I-CAM y E-selectina.

Esto correlacionó positivamente con la reducción de la adhesión de monocitos a las HUVECs por AO. Sorprendentemente, el AO también rescató varias características afectadas de la angiogénesis de GD-HUVEC. Por otra parte, el AO indujo la migración de C- y GD-HUVEC en ensayos de scratch, un efecto promotor que se correlacionó con el aumento en el número de adhesiones focales revelado por la paxilina. Finalmente, la complejación de AO en ciclodextrinas, mostró altas tasas de encapsulación y mejor solubilidad en agua en medios de cultivo celular. Cabe destacar que la nueva formulación de los complejos de AO mantuvo la actividad y la conservación del AO durante largos períodos de tiempo. Además, la actividad de los complejos se testó en células Mv1Lu y MDA-MB-231, mostrando una migración celular mejorada al exhibir el reclutamiento de un alto número de células, en las que también fue patente la sobreexpresión de c-Jun a lo largo del borde de la herida. Asimismo, los complejos de AO desencadenaron una migración compatible con la observada con AO libre, ya que indujeron la activación de EGFR, MAP quinasas y c-Jun. Estos efectos también mostraron la dinamización de paxilina y actina, junto con el aumento del número de adhesiones focales.

Notablemente, los complejos de AO impidieron que las células epiteliales sufrieran efectos los citotóxicos leves del AO. En resumen, esta tesis doctoral muestra un gran potencial del AO para la cicatrización de heridas debido a la mejora de varios aspectos de la cicatrización por sus efectos positivos sobre las células epiteliales y endoteliales. De hecho, el AO desencadena un fino mecanismo molecular que actúa en estas células y que vale la pena descifrar en su totalidad. Además, su nueva formulación mejorada con ciclodextrinas impulsa al AO como un agente cicatrizante para tratar heridas agudas y crónicas en el futuro, una afección que normalmente requiere mucho tiempo y conlleva tratamientos costosos. Por estos motivos, la formulación de AO podría utilizarse como un tratamiento alternativo para evitar estos problemas y mejorar la regeneración de la piel y, en definitiva, la vida de los pacientes.