Estudio multiple de polimorfismos genéticos en pacientes con linfoma de células B maduraú

Abstract

Actualmente la incidencia de tumores ha aumentado en la última década de manera exponencial, convirtiéndose desde 2007 en la segunda causa de muerte. De entre los diferentes tipos de tumores que afectan a células hematológicas, los de células B maduras ocupa un 8,4% del total de las causas de muerte en España. Entre las causas achacables a este suceso está el aumento de exposición a contaminantes ambientales xenobióticos (hidrocarburos aromáticos policíclicos, pesticidas organoclorados y organofosforados, piretroides,) y los propios fármacos policlorinados bifenílicos y dioxinas, entre otros; todo ello debido al gran desarrollo industrial en concreto en algunas zonas especificas. Este hecho puede explicar, en parte, la asociación entre el grado de desarrollo de un país y la mayor incidencia de ciertos tipos de cáncer. El mayor grado de exposición a tóxicos ambientales derivados de estas industrias en los seres humanos exigen un aumento las capacidades de detoxificación y reparación de posibles daños de los sistemas enzimáticos encargados de contrarrestar o frenar los procesos nocivos para nuestro organismo, observándose que entre la población existen diferentes capacidades de metabolización en función de pequeñas variaciones genéticas puntuales conocidas como polimorfismos genéticos. Por tanto, la interrelación entre susceptibilidad genética y exposición a sustancias con potencial carcinógeno está relacionado con el desarrollo de enfermedades hematológicas; ambos factores han de ser considerados juntos a fin de evaluar el riesgo de linfoma asociado a un individuo en virtud de ciertas condiciones ambientales , de tal forma que en el desarrollo de neoplasias de células B maduras (MBCN), que incluye a los linfomas Hodgkin (LH), a los linfomas No-Hodgkin (LNH), así como a las Gammapatías Monoclonales (MG), son en gran medida debidos a la combinación de la susceptibilidad genética y determinantes ambientales Esta susceptibilidad genética se pone de manifiesto en los polimorfismos genéticos que modifican la estructura y función de las proteínas (=enzimas) encargadas de: - Metabolización de tóxicos carcinogénicos. - Reparación de daños ocasionados por dichos tóxicos. La repercusión de esta alteración en la función enzimática de los sistemas de metabolización de xenobióticos y/o reparación del DNA puedan estar relacionados tanto con una mayor susceptibilidad a desarrollar enfermedades neoplásicas de Células B en individuos expuestos a tóxicos con potencial carcinógeno. En el presente estudio comparamos un grupo de casos frente a un grupo de controles estudiando sus polimorfismos genéticos y su relación con diferentes tipos de exposición (Tabaco, Zona de residencia, Sustancias Químicas y Laboral), en busca de una posible predisposición al desarrollo de enfermedades Hematológicas de células B maduras. ¿ Antecedentes o estado actual del tema. El desarrollo industrial ha provocado la aparición repentina de compuestos con potencial cancerígeno frente a los cuales el ser humano no ha podido desarrollar sistemas enzimáticos de defensa del todo adecuados. Este hecho puede explicar, en parte, la asociación entre el grado de desarrollo de un país y la mayor incidencia de enfermedades cancerígenas. Dentro de los productos industriales potencialmente tóxicos podríamos destacar los solventes policlorados, el benceno, los hidrocarburos aromáticos policíclicos, los pesticidas, las aminas aromáticas, entre otros. Diversos sistemas enzimáticos del organismo tienen como función la protección frente a sustancias exógenas con potencial tóxico. Dentro de estos sistemas de defensa podríamos destacar las enzimas de metabolización de xenobióticos, como primer mecanismo defensivo; y a las de reparación de daño en el ADN como el segundo nivel defensivo del organismo, una vez superados los mecanismos de reparación. Estos últimos detectan los errores del ADN y subsanan las alteraciones a nivel de bases nitrogenadas, la inclusión de aductos de ADN y/o rupturas en el esqueleto del ADN. En estas condiciones, a día de hoy se estudian polimorfismos en los genes que codifican: - Enzimas de detoxificación que determinan una distinta funcionalidad de las mismas y por consiguiente una diferente susceptibilidad interindividual a la hora de desarrollar cáncer condicionado, aunque sea en parte, a la presencia de sustancias químicas con potencial cancerígeno. Distintos polimorfismos en enzimas de metabolización se han relacionado con mayor riesgo de desarrollar LNH. - Polimorfismos en estos genes de reparación de daño al ADN y su posterior síntesis relacionados con un mayor riesgo de desarrollar cáncer.

OBJETIVOS El actual avance de las técnicas de biología molecular permite una caracterización individualizada del diagnostico y pronostico de diferentes tipos de tumores originados por alteraciones del material genético. Permitiendo establecer interrelaciones entre estas variantes genéticas, diferentes tipos de exposición (tabaco, zona de residencia, sustancias químicas o laborales), y la mayor susceptibilidad o incidencia al desarrollo de enfermedades hematológicas, en concreto de células B maduras, como los Linfoma No Hodgkin. - Determinar si la presencia de genotipos de GSTT1 constituye un factor de riesgo para el desarrollo de neoplasias maduras de células B en individuos expuestos. Considerando como factores de exposición: al tabaco, el residir en una zona próxima donde exista alta concentración de industrias químicas; o bien, por exposición ocupacional. - Conocer la asociación entre los polimorfismos asociados a PON1 y el riesgo de linfoma en individuos expuestos. - Comprobar el efecto de los polimorfismos en genes de reparación y síntesis del ADN en el riesgo de padecer cáncer.

Objetivos necesarios para el estudio: - Obtener una población de estudio, compuesta por Casos y Controles en número adecuado, comparables en edad, sexo, origen, etc. Evitar en todo momento cometer el error de recogida o sesgo de selección en la población. - Caracterizar a ambos grupos según diferentes tipos de exposición mediante una encuesta breve y anónima. - Extracción de ADN y genotipado de las muestras de casos y controles a estudio, utilizando para ello diversas técnicas moleculares. - Comparar un grupo de casos y un grupo control en función de la presencia de diferentes polimorfismos genéticos en enzimas de metabolización y reparación de ADN.

METODOLOGIA Y PLAN DE TRABAJO SEGUIDO La metodología seguida fue realizada comparando dos poblaciones, casos vs. controles con distintos grados de exposición. En cada una de estas poblaciones realizamos un estudio de casos coincidente con los controles en cuanto a sexo, edad y zona de salud. En las muestras recogidas determinamos ciertos polimorfismos en genes de detoxificación y de reparación del ADN. -Elección de la población a estudio. Comparamos un grupo Control frente a grupo de Casos; el estudio consta de 392 sujetos, de los cuales 175 son pacientes diagnosticados por los facultativos de los servicios de Hematología del Hospital Universitario Santa María del Rosell y del H. Morales Meseguer como enfermos Hematológicas de Células B maduras (NCBM) según la clasificación REAL/WHO (World Health Organization ¿ Organización Mundial de la Salud, OMS.2003). Este grupo se comparó a 214 individuos sanos que ejercieron como controles, provenientes en gran número del centro de Hemodonación de Sangre de la región de Murcia. En cada una de estas poblaciones realizamos un estudio de casos coincidente con los controles en sexo, edad, por exposición y zona de salud; en ambos grupos se realiza una subdivisión según la exposición a cuatro posibles causas: - Exposición al Tabaco - Exposición Ocupacional o Laboral - Exposición por zona de residencia. - Exposición a sustancias químicas Las categorías se establecieron gracias a que los sujetos a estudio rellenaron una simple encuesta anónima y voluntaria, en la que se recogían datos sobre sus hábitos de vida. Dicha encuesta fue aprobada por el comité de Etica Local, en la que aseguraba la anonimidad de los datos y que dichos datos eran necesarios para un estudio científico.

-Elección de las áreas geográficas para el estudio etiológico Para el estudio etiológico elegimos el área de Salud Área de Salud II de Murcia (300.000 habitantes) que comprende el Campo de Cartagena, una área importante de cultivo de hortalizas en invernaderos y el núcleo urbano de Cartagena (190.000 habitantes) con las industrias que lo rodean. La elección de la zona no se hizo al azar, puesto que en ella hay zonas con alto grado de exposición ambiental. Este criterio nos sirve para definir las dos zonas que hemos escogida como zona expuesta por residencia: ¿Campo de Cartagena¿ y ¿Polo Químico del Valle de Escombreras¿. La primera de ellas, ¿Campo de Cartagena¿ es una zona de alto uso intensivo agrícola donde se presupone el uso de pesticidas y fertilizantes en gran medida. Respecto a la segunda, el Valle de Escombreras, fue declarada en 1979 como ¿Zona de Atmósfera Contaminada¿ por el Consejo de Ministros y como tal cuenta desde 1990 con un Plan Operativo de Intervención Industrial que obliga a parar la actividad industrial cuando se superan los límites admisibles. Como ejemplo durante el año 1999 se tuvo que parar la producción industrial en 81 ocasiones la mayoría de las veces por niveles inadmisibles de partículas en suspensión.

En un estudio publicado por la Consejería de Sanidad se observó que en el municipio de Cartagena existía una mayor incidencia de cáncer en general y de pulmón, próstata, vejiga, estómago y colon en particular cuando se comparó con la situación en otras zonas de la región. También se observó que los distritos del municipio próximos a los focos contaminantes mostraban una incidencia de cáncer dos veces mayor que en los distritos más alejados. Fue en el año 1973 y por iniciativa de la Escuela Universitaria Politécnica empezaron a medirse los niveles de emisión en su propio edificio y la zona adyacente a Cartagena, y en 1974 cuando la Subdirección General de Medicina Preventiva y Sanidad Ambiental creó una unidad técnica de análisis y recepción de datos. En 1990 dicha zona fue declarada dentro de un contexto de un Plan Operativo de Intervención Industrial que obliga a parar la actividad industrial cuando se superan los límites admisibles, dicha zona fueron declaradas en 1990 como ¿Zona de Atmósfera Contaminada¿ por el Consejo de Ministros. Según el estudio ¿Atlas municipal de mortalidad por cáncer en España¿ (1989-1998) realizado por el Centro Nacional de Epidemiología del Instituto de Salud Carlos III, los habitantes de Cartagena tienen un riesgo un 50% mayor que el resto de la población española de padecer cáncer de pleura. Así mismo también superamos la media nacional en riesgo de cáncer de pulmón, color-rectal, melanoma, útero, próstata, vejiga, mieloma múltiple y leucemias. Por tanto, la información de la exposición por la localización geográfica de su residencia ha sido obtenida comparando dicha zona de residencia con las zonas ¿Zonas de Atmosfera Contaminadas¿; obteniendo los datos mediante la consulta d elas historias clínicas de los pacientes controles. -Selección y caracterización de los polimorfismos más significativos La selección de polimorfismos se hace sobre la base de una odds ratio (OR) mayor 1.8 y una frecuencia en la población caucásica mayor del 10%; eligiendo polimorfismos de genes: - Metabolización de xenobióticos. Son numerosos los sistemas enzimáticos forman parte del conjunto de vías metabólicas por medio de los cuales los tejidos incrementan la polaridad de un tóxico no polar, facilitando su solubilidad en agua, nos centramos en los polimorfismos de los genes que codifican a las enzimas: Ø GSTT1 y GSTM1; conocidas como Glutatión-transferasas participan en la desintoxicación de compuestos electrofílicos, incluyendo los agentes carcinógenos, de drogas terapéuticas, de toxinas ambientales y de productos de la tensión oxidativa, por la conjugación con glutatión Ø NQO1: es quinona oxidoreductasa 1 o diaforasa (NQO1) es una reductasa implicada en la activación/detoxicación de quinonas (por ejemplo, mitomicina C) y de compuestos activos similares, incluyendo los metabolitos del benceno (hidrobenzoquinona, benzoquinona). Ø PON1-rs662; paraoxonosa conocida inicialmente con este nombre por su capacidad de hidrolizar compuestos organofosforados derivados del insecticida paratión, es una enzima implicada en la hidrólisis del metabolito oxigenado (oxon) a nivel hepático y sérico de diversos insecticidas organofosforotionatos (entre ellos el paratión, clorpirifos, diazinon). Ø EPHX1-rs1051740 epóxido hidrolasa microsomal 1 (EPHX1) juega un papel importante tanto en la activación y detoxificación de compuestos aromáticos policíclicos, como son los carcinógenos epóxidos derivados del tabaco

- Reparación de daño en el ADN y síntesis de ADN. Estas enzimas tienen como funcion de detectar, subsanar y sintetizar las alteraciones a nivel de bases nitrogenadas así como rupturas en el esqueleto del ADN. Ø XPA-rs1800975, el nombre proviene de la enfermedad que ocasiona el déficit Xeroderma Pigmentosum, es una enzima que forma parte de los sistemas de reparación del DNA son proteínas que escanean el DNA para detectar alteraciones. Ø ERCC5-rs17655 del inglés (Excision Repair cross-complementing) genes que codifican un grupo de proteínas implicadas en la reparación y escisión del DNA; está involucrado en la reparación de la escisión de la radiación UV-daño en el ADN inducido reparación de la proteína ADN complementa-G células XP es una proteína que en los humanos está codificada por el ERCC5 reparación por escisión transversal Ø MTR-rs1805087; metionina sintetasa, cataliza la conversión del aminoácido homocisteina (Hcy) en metionina (Met) mediante la transferencia irreversible de un grupo metilo a partir del 5-metiltetrahidrofolato. El gen de la proteína MTR es polimórfico en el nucleótido 2756 (A a G) y se ha asociado con disminución de los niveles de homocisteína en plasma, por disminución de la actividad enzimática.

-Elección de la técnica de Genotipado Para todos los polimorfismos excepto el EPHX1 rs1051740, se dispone de sondas comerciales TaqMan de Applied Biosystems que están validadas y deben funcional bien separando las muestras en tres grupos (homocigotos para un alelo, homocigotos para el otro alelo y heterocigotos). El genotipado con este tipo de sondas se basa en primers específicos de alelo que contienen dos tipo de flurocromos según el alelo y un apantallador o quencher de esta florescencia. Cuando hay amplificación de un alelo determinado la actividad exonucleasasa de la polimerasa empleada rompe el cebador específico de alelo y libera al fluorocromos de la presencia del apantallador emitiendo así una determinada florescencia.

Para EPHX1 rs1051740 empleamos la tecnología Amplifluor en la cual se emplean cebadores específicos de alelo con una secuencia consenso a la que se hibridarán posteriormente los fluorocromos FAM y JOE (. El diseño de cebadores se hace gracias a la aplicación informática: https://apps.serologicals.com/AAA/ design/inputSequences.aspx?reset=true) Para el genotipado de GSTT1 no se dispone de sonda TaqMan pues no es un polimorfismo de SNPs sino de presencia-ausencia. Por esta razón haremos el genotipado con una PCR-Multiplex incluyendo un control interno de amplificación de un fragmento de un gen endógeno como la Beta-globina como han descrito otros trabajos.

-Diseño de primers/sondas Para todos los polimorfismos salvo GSTT1 null (no es de SNPs) se dispone de sondas comerciales TaqMan de Applied Biosystems. Para EPHX podemos diseñar unos primers para realizar la detección con AmpliFluor. Para el diseño de los primers del GSTT1 empleamos el programa primer3 (www.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). De esta forma, el amplicón del GSTT1 será de 205 pb y el de la ¿-globina 268pb. Estos fragmentos son fácilmente identificables separándolos en un gel de agarosa al 2%. El ADN obtenido de tejido parafinado sería inviable para esta determinación. -Condiciones de amplificación del GSTT1/beta-globina/GSTM1 Volumen total: 10microl. Oligonucleótidos 2 pmol de cada uno, dNTP 2mM, buffer Taq pol 1X, MgCl2 3.75mM, DNA 0.1 microg, Taq pol 0.5 U. Programa de amplificación: 95º 2 min; 10X(94º 15s, 58º 15s, 72º 20s); 24X(94º 15s, 61º 15s, 72º 20s); 72º 3 min. -Condiciones de amplificación del resto de polimorfismos Las condiciones serán las descritas por el fabricante de la sonda -Análisis de datos Se empleará métodos de comparación de variables tanto cualitativas como cuantitativas como son el test de Fisher o el Chi cuadrado, test de Levene de comparación de medias, disponibles en el paquete estadístico SPSS (v. 15.0 Chicago-Ilinois) o también se va a usar el paquete estadístico EPidat, software libre de la universidad de Galicia.

RESULTADOS - RESULTADOS DEL SNP GSTT1 Y GSTM1: El genotipado se realizó con éxito en todos los sujetos de estudio, se muestran los resultados globales tras genotipar casos vs. controles; no observándose diferencias significativas entre ambos grupos. Posteriormente al análisis de la población en general se hizo un estudio pormenorizado de cada polimorfismo por grupos poblacionales y tipos de exposición, analizando el papel de los distintos grupos de linfomas y los controles. No se observa diferencia significativa entre grupos de pacientes con LF y LBDCL y controles para el genotipo GSTT1, pero si para los pacientes con LH. En cuanto al polimorfismo GSTM1 vemos como el genotipo nulo es más frecuente en pacientes con LF que en los controles (39.6% vs 55.6%: P =0.007; OR =0.53, CI: 0.32¿ 0.86). No se observaron diferencias significativas para el resto de comparaciones en dicho polimorfismo.

- RESULTADOS DE LOS SNP DE ENZIMAS DE METABOLIZACIÓN: EPHX1, NQO1 y PON1, El genotipado de casos y controles fue realizado a casi todos los sujetos del estudio, a excepción de 9 casos para el genotipo EPHX y dos para NQO1 que no pudieron genotiparse con éxito. La distribución de genotipo fue consistente con la ley de Hardy-Weinberg (p=0.187, 0.892 y 0.228; respectivamente). Los resultados para las frecuencias genotípicas fueron similares a las dadas por HapMap-CEU para individuos europeos: - EPHX1: TT 54.8%, TC 36.7%, CC 8.5%. - NQO1: CC 59.5%, CT 35.0%, TT 5.4%. - PON1: AA 42.7%, AG 47.3%, GG 10.0%. No se observamos diferencias significativas para los polimorfismos NQO1 y EPHX respectivamente. Al contrario si observamos una asociación significativa del genotipo GG del polimorfismo del gen PON1 con un posible desarrollo de linfoma, (15.3% vs. 4.7%; OR = 3.7 CI (95%): 1.8-7.7; p < 0.001).). Dicha asociación se observa principalmente con el género masculino (p = 0,008) pero no con el femenino (p = 0,05). Los datos muestran que en el caso del polimorfismo PON1, son más frecuentes los casos portadores del genotipo GG en LF (14,1%) y LBDCL (17,1%) que en los controles, siendo las diferencias entre estos grupos y los controles significativas. Por el contrario, los casos LH (14,3%) no mostraron esta asociación.

- RESULTADOS DE LOS SNP DE ENZIMAS DE REPARACIÓN Y SÍNTESIS DE ADN (ERCC5, XPA Y MTR) Se realizó el genotipado de todos los sujetos a estudio. Los resultados se muestran en la tabla y pueden observarse que las frecuencias genotípicas obtenidas son similares a las dadas por HapMap-CEU para población Europea [http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov]. No se detectaron diferencias significativas en la distribución de genotipos para los polimorfismos rs1800975, rs1805087 y rs17655 entre casos y controles en general, ni cuando se realiza distribución por tipos de linfomas, como puede verse en la tabla anterior.

CONCLUSIONES: Ø Nuestros resultados apoyan que la presencia del genotipo GSTT1 nulo es un factor de riesgo para el desarrollo de neoplasias maduras de células B. Este efecto fue particularmente prominente en las mujeres. No podemos asegurar que el tabaquismo y la exposición ocupacional a compuestos químicos estén implicados en el proceso carcinogénico, en los individuos expuestos. Ø Nuestro estudio es el primero en describir que el polimorfismo rs662 PON1 en línea germinal se asocia con el riesgo de linfoma, aunque los resultados han de ser confirmados en estudios independientes posteriores con mayor tamaño muestral. Ø La asociación del polimorfismo rs662 PON1 con el desarrollo a linfoma de células B maduras muestra una dependencia con la proximidad de industrias químicas de los sujetos de estudio. Ø Para los polimorfismos rs1800975, rs1805087 y rs17655 en los genes XPA, ERCC5 y MTR, implicados reparación y síntesis del ADN, no observamos una relación con mayor riesgo de linfoma sugiriendo que no desempeñan un papel importante en la linfomagénesis.